自身免疫系统疾病动物模型—杭州赫贝经验介绍

自身免疫系统疾病动物模型是医药研发与科学研究的重要工具,到目前为止,已经确定了80多种自身免疫性疾病,这些疾病影响了全球10%以上的人口,比较常见的如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病、咳喘及特应性皮炎等。由于大部分自身免疫性疾病的发病机制尚不明确,可能与遗传、环境、免疫等多种因素有关,因此借助动物模型来探究疾病作用机理或进行临床前药效测试就显得尤为重要。

由于自身免疫性疾病在病因学和病理学上的复杂性,通常还会使用一些手段诱导动物发生自身免疫性疾病。例如,在类风湿性关节炎的研究中,有一种常用的动物模型是胶原诱导的类风湿性关节炎(CIA)模型。研究人员会通过注射Ⅱ型胶原蛋白与佐剂来诱导小鼠关节炎的发生。这种模型的小鼠发病程度、节点较为稳定,严重程度区分度较高,特别适用于抗自体免疫性疾病药物的评价。又比如,在银屑病的研究中,有一种常用的动物模型是咪喹莫特诱导的小鼠银屑病皮损模型。咪喹莫特是Toll样受体7/8的抑制剂,临床上用来医疗病毒病染。研究人员会使用咪喹莫特乳膏在小鼠背部连续涂抹,从而诱导出类似银屑病的皮肤病变。总的来说,动物模型不只可以帮助我们理解自身免疫性疾病的发病机制,而且还是我们寻找新的诊断方法和医疗方法不可或缺的工具。

下面我们就来介绍一下赫贝科技关于自身免疫系统疾病动物模型的构建经验,以帮助大家更好的选择合适的动物模型用于临床前药效测试和疾病发病机理研究。

1 特应性皮炎及AD小鼠模型复制

特应性皮炎(Atopic Dermatitis, AD)是一种常见的慢性、复发性、炎症性皮肤病,又叫特应性湿疹、异位性皮炎、遗传过敏性皮炎,主要表现为皮肤干燥、湿疹样皮疹、剧烈瘙痒等。目前,它的发病原因尚不完全清楚,可能与遗传因素、环境因素、免疫系统异常等有关。

特应性皮炎动物模型主要通过药物诱导产生,常用的诱导剂包括DNCB(2,4-二硝基氯苯)和OXA(Oxazolone,恶唑酮)进行诱导,两种造模方式均可以成功的复制特应性皮炎模型。但是,两种药物诱导的模型在表现上又存在部分差异,采用DNCB(2,4-二硝基氯苯)进行诱导会产生明显的皮肤破损,采用OXA(Oxazolone,恶唑酮)进行诱导则动物瘙痒更为明显。

以DNCB(2,4-二硝基氯苯)诱导模型为例,赫贝科技在该模型复制中改良了DNCB的诱导浓度,明确了检测指标并尽可能做到指标量化,方法稳定可靠。具体造模方法和检测指标如下:

造模方法:用:橄榄油比例为3:1溶液作为溶剂配制1.0%、0.5%DNCB。第1、4d,模型组用200ul 1.0% DNCB 擦拭刮毛区致敏,其余2-7d 动物正常饲养,从8d开始每2d用200ul 0.2% DNCB擦拭1次,持续刺激3周(即第8,10,12,14,16,18,20、22、24、26、28、30、32d),第33d试验结束。

检测指标:大体观察、皮肤抓挠次数、皮损严重程度评分、IgE血清含量检测、皮肤组织病理学改变、肥大细胞数量变化。

2 类风湿性关节炎及RA大鼠模型

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA))是一个累及周围关节为主的系统性炎症性自身免疫病,主要表现为慢性、对称性、进行性多关节炎,像关节疼痛、关节肿胀、晨僵等都是比较常见的症状。随着病情进展,还可能导致关节畸形和功能丧失。虽然它的病因尚不完全清楚,但可能和病染因子、遗传倾向等因素有关。在医疗方面,有药物医疗,像非甾体抑菌药、抗风湿药、糖皮质激动素等;还有物理医疗,比如热疗、冷敷、按摩等;手术医疗主要用于晚期出现严重关节畸形、功能障碍的患者。避免寒湿环境、适度运动、健康饮食、规律作息、减轻压力这些方面也可以起到很好的预防效果。

类风湿性关节炎动物模型频繁应用于RA发病机制、影响因素和医疗方法研究,其模型包括药物诱导型和转基因型两大类。诱导型RA,模型的药物主要为II型胶原蛋白或卵清蛋白,操作方法简单可行,成本低。转基因型RA主要包括TNF-α转基因小鼠,K/BxN转基因模型等,转基因模型与人具有相似的RA症状。
胶原诱导型关节炎(CIA)是使用很频繁的RA模型,CIA模型在临床症状、病理学改变及免疫反应方面与人类RA高度相似。赫贝科技通过长期的摸索,建立了稳定的CIA大鼠模型复制和检测体系,具体的造模方法和检测指标如下:
造模方法:将浓度为2mg/mL的牛II型胶原冰醋酸溶液,置于4℃冰箱过夜;然后和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化,制成C II乳化剂。首先天于大鼠尾部背侧(距尾部约2cm处)进行初次免疫皮内注射乳化剂,每只0.2mL;初次免疫后七天继发免疫,于大鼠尾部腹侧皮内注射乳化剂,每只0.1mL,一共注射两次建立模型。

检测指标:关节肿胀评分、痛阈检测、micro-CT检测骨质变化、HE染色观察软骨和软骨下骨病理学改变、ELISA检测炎症因子变化。

3 炎症性肠病和IBD小鼠模型

炎症性肠病(IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病,主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)两种类型。其主要临床表现为腹泻、肚子疼、黏液脓血便等。此外,患者还可能出现里急后重、腹块、肛门症状以及恶心、呕吐、食欲缺乏等并发症引起的临床表现。全身症状包括贫血、发热、营养不良等。病情轻重不一,多呈反复发作的慢性病程。IBD的发病机制尚不明确,可能涉及遗传、环境、病染、免疫等多个因素。遗传因素在IBD的发病中起着重要作用,约有20%的IBD患者有家族遗传史。环境因素如生活环境污染、饮食习惯、吸烟等也可能诱发或加重IBD。此外,肠道黏膜免疫系统异常反应导致炎症反应被认为是IBD的主要发病机制。

为了深入研究IBD的发病机制和医疗方法,科学家们建立了多种IBD动物模型。这些模型主要通过化学诱导、基因缺陷或T细胞移植等方式模拟人类IBD的病理特征。化学诱导模型:如葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型和三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型。DSS模型通过给小鼠饮用含有DSS的饮用水来诱导急性或慢性结肠炎,其病理特征与人类UC相似。TNBS模型则是通过结肠灌注TNBS来诱导透壁结肠炎,其组织学和免疫学特征与人类IBD相似。基因缺陷模型:如I-κ-B激酶γ(Iκκ-γ)和白细胞介素(IL)-10基因缺陷模型。这些模型通过基因敲除或突变来模拟人类IBD的免疫异常。T细胞移植模型:通过用CD25耗尽的CD4细胞重建SCID/RAG小鼠来诱导结肠炎。这种模型可以模拟人类IBD中T细胞介导的炎症反应。

这些动物模型为科学家们提供了深入研究IBD发病机制和医疗方法的重要工具。通过这些模型,科学家们可以更好地理解IBD的病理生理过程,并筛选出潜在的医疗药物和方法。葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型和三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的结肠炎模型在日常研究中被频繁使用,如下为TNBS诱导的IBD模型造模方法和检测指标。
造模方法:腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)溶液麻醉小鼠,5%TNBS和无水乙醇按1∶1体积比混合后注入100μL于小鼠直肠,并将小鼠倒立4 min。
检测指标:肠炎疾病活动度评分、肠组织HE染色进行炎症评分、按照ELISA试剂盒说明书检测肠黏膜组织中TNF-α、IL-6及IL-1β的水平。

结肠炎疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分标准

组织病理学评分标准

4 系统性红斑狼疮及SLE疾病小鼠模型

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫介导的,以免疫性炎症为突出表现的,累及多系统、多部位、多组织损害的慢性全身性疾病。其发病原因尚不完全清楚,一般认为主要与遗传有关,环境因素是一个次要因素。目前,医疗手段无法根除SLE,只能通过长期应用激动素和免疫抑制剂控制病情。

在寻找特定的致病机制、开发针对性的干预措施以及更具潜力的医疗药物的过程中,选择合适的动物模型显得尤为重要。SLE动物模型主要为自发性动物模型,主要包括NZB/W F1小鼠模型、MRL/lpr小鼠模型、BXSB/MpJ小鼠模型。其中MRL/lpr小鼠模型:由LG/J、AKR/J、C3H/HeDi和C57BL/6J品系小鼠复杂交配产生,由于缺失Fas基因,出现淋巴细胞增生基因,导致T细胞死亡率降低,淋巴结肿大,表现出部分狼疮样病理特征。此模型病变与人体SLE十分相似。
造模方法:转基因小鼠模型。

一般观察:每周观察小鼠生存状态,记录各组小鼠体重变化及其他不良反应。连续观察10周后(即19周龄)为实验终点。

检测观察:尿蛋白检测、免疫部位指数测定、ELISA法检测血清抗核抗体(ANA)、抗dsDNA抗体含量、肾组织病理学观察和免疫复合物沉淀检测。

5 咳喘及Asthma疾病小鼠模型

咳喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病,患者在遇到刺激物或过敏原时,会出现呼吸急促、喘息、咳嗽等症状。而咳喘动物模型是一种用于研究咳喘病理生理机制及药物医疗效果的动物模型,常用于临床前新药筛选和药效评价等领域。咳喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症,由此导致患者的气道高反应性(气道对各种刺激因素出现过强或过早的收缩反应),造成气道缩窄,气流受阻。临床上表现为反复发作性喘息、呼气性呼吸困难、胸闷和咳嗽等症状。

目前已建立了许多咳喘动物模型,包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、犬、兔、羊及猴等,其中常用的是小鼠、大鼠和豚鼠。这些模型通常通过诱导的方式来建立。以OVA诱导的咳喘模型被频繁使用,具体方法和检测指标如下:
造模方法:小鼠在D0、D7、D14时间用卵蛋白100μg+氢氧化铝1mg凝胶致敏,每只0.2ml,共三次,D21开始用浓度为5%OVA雾化30min。
检测观察:BALF中白细胞及嗜酸细胞(EOS)计数、肺组织病理学观察、肺组织炎症因子检测。

总结

自身免疫系统疾病动物模型是医药研发与科学研究中用于探究疾病作用机理或进行临床前药效测试的重要工具。常见的自身免疫系统疾病动物模型主要包括:特应性皮炎、风类湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、咳喘等,这些动物模型为科研人员提供了重要的研究工具,有助于更深入地了解自身免疫系统疾病的发病机制,并为开发新的医疗药物和方法提供有力支持。赫贝科技拥有成熟的模型复制经验和检测经验,可以为相关药物研发的企业提供可靠的临床前动物实验服务。